Analiza genetyczna

Projekt Zostera oprócz badań in vitro zawiera bardzo istotny element jak badania genetyczne. Są one niezwykle istotne ponieważ od wielu lat funkcjonuje teoria iż w Polskiej strefie brzegowej występują tylko i wyłącznie klony jednego osobnika. Podjęto wiec próbę sprawdzenia czy teoria ta jest zgodna z rzeczywistością.
Do przeprowadzenia tego typu badan niezbędna jest informacja w jaki sposób zbierać materiał aby nadawał się on do badań genetycznych. Informacji dostarczył Thorsten Reusch udostępniając projektowi metodykę poboru sporządzoną przez Olsen et al. 2004, Reusch et al. 2000, Reusch 2002, Ferber et al. 2004. Prezentowany poniżej protokół został wykorzystany to oszacowania około 60 populacji Zostera marina na całym świecie.

Jak pobierać próbki trawy morskiej do analiz genetycznych

Obszar poboru próbek: 40 m (równolegle do brzegu) x 20m (prostopadle do brzegu) z gęstych łąk maksymalnie z 2-3 m głębokości. Odstępstwa od tych wytycznych są możliwe jeśli: a) habitaty są niejednolite b) nachylenie stoku dna jest ostre i trawy morskie rosną w najwęższym paśmie wzdłuż brzegu.
Ilość próbek = 50
Najbardziej pożądana metoda: wybrać punkty poboru losowo w obrębie koordynatów x y podanych w punkcie 1 (najlepiej do poboru wynająć doświadczonych nurków- na około 3-4 osobogodziny).
Opcja druga: przypadkowy zbiór materiału wzdłuż 40m transektu. Należy pamiętać o zachowaniu co najmniej 1m odległości od poszczególnych miejsc aby nie pobrać osobnikowi tego samego klonu. Próbki najlepiej zbierać do woreczków strunowych typu "Ziploc"(oczywiście mogą być ich odpowiedniki). Próbki powinny zawierać 2-3 cm kawałki trawy morskiej odcięte bezpośrednio pod woda z rosnących roślin. Nie wyrywać! Trawa morska zgodnie z ustawą z dnia 5 stycznia 2012 r. Dz. U. z 2012 r. Nr 0, poz. 81 podlega w Polsce ochronie gatunkowej.
Z doświadczeń uzyskano najefektywniejsza metodę podwodnego poboru materiału polegającą na użyciu woreczków strunowych o pojemności mniej więcej 2-4 L. Woreczki należy ponumerować a następnie skleić ze sobą tylko dolnymi brzegami np. taśmą duct tak by stworzyć cos w rodzaju ksiązki. Najbardziej wygodne jest użycie około 10 woreczków na raz. Woreczki są łatwe w użyciu a co ważniejsze wielokrotnego użytku. Jeśli pod woda pracuje 2 nurków najlepiej podzielić prace tak by jedna osoba odcinała próbki a druga pakowała je do woreczków.
Jeśli czas jest ograniczony, można zebrać 50 roślin w jednym pakiecie i pakować je juz na łodzi/lądzie do woreczków. Należy pamiętać że każdy pakiet musi zawierać liście roślin rosnących od siebie w odległości nie mniejszej niż 1 m. Ponadto pakiet nie powinien składać sie z kilku liści tego samego kłącza ponieważ spowoduje to zawyżenie szacunków przy analizie genetycznej.
Przechowywanie materiału na "sucho": należy przygotować 2 ml eppendorfki (próbówki Eppendorfa) wypełnione do połowy żelem silikonowym. Z większej rośliny należy odciąć 2-3 cm zielonego liścia (co zazwyczaj oznacza pierwszy lub trzeci liść) osuszyć papierowym ręcznikiem (to jest bardzo ważne by były suche!) i włożyć do eppendorfki.
Próbki również mogą być przechowywane w małych woreczkach strunowych wypełnionych 3-5 g żelem sylikonowym. Żel laboratoryjny zazwyczaj ma właściwości zmiany koloru informujące o stopniu zawilgocenia. (np. niebieski- suchy, różowy lub pomarańczowy lub biały- mokry itp.) Kryształki mogą być wysuszone w każdym momencie w 50-60°C (lub należy przestrzegać informacji od producenta danego żelu).
Jeśli żel silikonowy nie jest dostępny, można wysuszyć rośliny pomiędzy kartkami papieru w taki sposób jak przygotowuje się zielniki. Należy upewnić się że rośliny wysychają szybko.
Zanotuj miejsce i poszczegolne osoby identyfikujace na probowce/ worku uzywajac markera wodoodpornego. Zanotuj głębokość/ koordynaty GPS/Note down site and individual identifier with water proof felt pen on bag /tube. Please provide info on water depth /GPS coordinates /wielkość łąki i inne uzyteczne informacje dotyczące habitatu.
Nie nalezy przejmowac sie jesli jakas czesc epifitow pozostanie na lisciach (primery PCR zostały wyselekcjonowane dla trawy morskiej).
Po calkowitym wysuszeniu probki sa gotowe do wysylki do labolatorium.

Thorsten Reusch, Leibniz-Institute of Marine Sciences IFM-GEOMAR, Düsternbrooker Weg 20, 24105 Kiel, Germany

Referencje

Ferber S, Stam WT, Olsen JL (2008) Genetic diversity and connectivity remain high in eelgrass Zostera marina populations in the Wadden Sea, despite major impacts. Mar Ecol Prog Ser, 372, 86-97.
Olsen JL, Stam WT, Coyer JA, et al. (2004) Population differentiation and post-ice age recolonization of the North Atlantic by the seagrass Zostera marina L. Mol. Ecol., 13, 1923-1941.
Reusch TBH (2002) Microsatellites reveal high population connectivity in eelgrass (Zostera marina) in two contrasting coastal areas. Limnol. Oceanogr., 47, 78-85.
Reusch TBH, Stam WT, Olsen JL (2000) A microsatellite-based estimation of clonal diversity and population subdivision in Zostera marina, a marine flowering plant. Mol. Ecol., 9, 127-140.